Mot-clés : Microscopie 3D, Fluorescence, Déconvolution, Monte-Carlo, réponse impulsionnelle optique,
polynômes de Zernike.
Keywords : 3D microscopy, deconvolution, Monte-Carlo, PSF analysis and modelisation, zernike moment, 3d
fluorescence, digital signal analysis
Généralités : formation de l'image, déconvolution et réponse impulsionnelle.
La microscopie de fluorescence 3D est un outil efficace d'analyse des échantillons biologiques vivants.
Lors du processus d'acquisition de l'image g(x,y,z), l'objet f(x,y,z) est convolué avec la
réponse impulsionnelle optique (RIO ou PSF pour 'point spread function' en anglais) h(x,y,z) du microscope
:
D'un point de vue général, l'amélioration de l'analyse des images 3D obtenues nécessite l'amélioration
de l'appareil de mesure ou le développement d'outils de traitement du signal.
La connaissance de la RIO et de l'image
permettent d'envisager une amélioration de l'image par l'opération inverse (déconvolution). Cependant,
ce problème inverse étant mal posé, une étape de régularisation est nécessaire et nécessite
l'intervention de l'utilisateur. Par ailleurs, l'opération de convolution suppose la non-invariance spatiale
de la RIO : la réponse impulsionnelle est identique quelquesoit le point de l'échantillon.
Les travaux de l'axe fluorescence 3D du
laboratoire concernent l'amélioration des images grâce à des techniques de déconvolution associées à la
connaissance de la réponse impulsionnelle du système.
La mise au point d'algorithmes de déconvolution s'appuie ainsi sur un savoir faire acquis dans la mesure et
le calcul (modélisation) de cette réponse impulsionnelle. L'automatisation de la procédure, rendant
plus facile l'utilisation de tels algorithmes du point de vue utilisateur, est également un objectif.
Déconvolution assistée, RIO et standardisation.
Les algorithmes de déconvolution développés permettent de trouver automatiquement les paramètres de
régularisation, habituellement fixés par l'utilisateur. Un préfiltrage est également utilisé pour améliorer la
stabilité
de ces algorithmes. Grâce à cette automatisation, les résultats obtenus sont moins subjectifs et présentent
une meilleure
reproductibilité.
La réponse impulsionnelle optique
permet de caractériser les
propriétés du système imageant. Dans le cas où la RIO est mesurée expérimentalement, des outils statistiques
associés aux moments de Zernike sont utilisés pour décrire la RIO 3D et quantifier ses variations.
Les polynômes de Zernike peuvent être utilisés pour traiter la RIO expérimentale : les caractéristiques
du
système sont préservées et le bruit est atténué.
Ceci constitue une première étape vers la mise au point d'un protocole de standardisation.
Limites et perspectives
La microscopie de fluorescence 3D souffre de certaines limitations : perte de fluorescence dans le
temps (photoblanchiment ou 'photobleaching'), phototoxicité ou
encore influence des propriétés optiques de l'échantillon sur l'observation 3D.
Pour résoudre ce dernier problème, un couplage avec la microscopie tomographique diffractive est envisagé.
En effet, l'hypothèse de non-invariance de la RIO est mise en défaut lorsque l'échantillon est inhomogène.
Les algorithmes de déconvolution devraient prendre en compte les variations de la RIO. Un tel algorithme,
basé sur une solution de type Monte-Carlo, a été développé au laboratoire.
Le couplage entre la carte d'indice 3D, obtenue par tomographie diffractive, avec l'information de
fluorescence devrait ouvrir la voie à de nouvelles possibilités en microscopie 3D.